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Novo ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência para glicosiltransferases baseado na derivatização com ácido antranílico e detecção de fluorescência.

Os ensaios foram desenvolvidos usando a química de marcação exclusiva do ácido 2-aminobenzóico (2AA; ácido antranílico, AA) para medir as atividades de β1-4 galactosiltransferase (GalT-1) e α2-6 sialiltransferase (ST-6) por líquido de alto desempenho cromatografia (HPLC) com detecção de fluorescência (Anumula KR. 2006. Avanços em métodos de derivatização de fluorescência para análise cromatográfica líquida de alto desempenho de carboidratos glicoproteicos. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglucosamina (GlcNAc) e N-acetillactosamina foram usados ​​como receptores e uridina difosfato (UDP)-galactose e citidina monofosfato (CMP)-ácido N-acetilneuramínico (NANA) como doadores para GalT-1 e ST-6, respectivamente.Os produtos enzimáticos foram marcados in situ com AA e foram separados dos substratos em coluna TSKgel Amida 80 usando condições de fase normal.As unidades enzimáticas foram determinadas a partir das áreas dos picos por comparação com os padrões derivados concomitantemente Gal-β1-4GlcNAc e NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.A linearidade (tempo e concentração da enzima), a precisão (intra e interensaio) e a reprodutibilidade dos ensaios foram estabelecidas.Verificou-se que os ensaios são úteis no monitoramento das atividades enzimáticas durante o isolamento e purificação.Os ensaios foram altamente sensíveis e tiveram desempenho igual ou melhor do que as medições tradicionais baseadas em açúcar radioativo.O formato do ensaio também pode ser usado para medir a atividade de outras transferases, desde que os receptores de carboidratos contenham uma extremidade redutora para marcação.Um ensaio para aceitadores de glicoproteínas foi desenvolvido usando IgG.Um método curto de perfilagem de HPLC foi desenvolvido para a separação de glicanos IgG (biantenários G0, G1, G2, mono e disialilados), o que facilitou a determinação das atividades de GalT-1 e ST-6 de maneira rápida.Além disso, este método de criação de perfil deve ser útil para monitorar as alterações nos glicanos IgG em ambientes clínicos.