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A análise de eventos de fosforilação em todo o proteoma ainda é um grande desafio analítico devido à enorme complexidade das redes de fosforilação de proteínas.Neste trabalho, avaliamos a complementaridade de Lys-N, Lys-C e tripsina quanto à sua capacidade de contribuir para a análise global do fosfoproteoma.Uma versão refinada de troca catiônica forte de baixo pH foi usada para separar eficientemente peptídeos N-terminalmente acetilados, fosforilados e não modificados.Um total de 5.036 fosfopeptídeos não redundantes pode ser identificado com uma taxa de descoberta falsa de <1% a partir de 1 mg de proteína usando uma combinação das três enzimas.Nossos dados revelaram que a sobreposição entre os conjuntos de dados de fosfopeptídeos gerados com diferentes proteases foi marginal, enquanto a sobreposição entre dois conjuntos de dados trípticos gerados de forma semelhante foi pelo menos 4 vezes maior.Desta forma, o uso paralelo de Lys-N e tripsina permitiu um aumento de 72% no número de fosfopeptídeos detectados em comparação com a tripsina sozinha, enquanto um experimento de replicação de tripsina levou a um aumento de apenas 25%.Assim, ao focar apenas nos dados de tripsina e Lys-N, identificamos 4.671 fosfopeptídeos não redundantes.Uma análise mais aprofundada dos locais detectados mostrou que os conjuntos de dados de Lys-N e tripsina foram enriquecidos em motivos de fosforilação significativamente diferentes, evidenciando ainda que as abordagens multiprotease são muito valiosas nas análises de fosfoproteoma.