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A fosforilação de proteínas regula diversas funções celulares e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento inicial das plantas.Para complementar e expandir as investigações anteriores de fosforilação de proteínas em mudas de Arabidopsis, usamos uma abordagem alternativa que combina a extração de proteínas em condições não desnaturantes com enriquecimento por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC) de fosfoproteínas intactas em extratos depletados de Rubisco, seguido de identificação usando eletroforese bidimensional em gel (2-DE) e cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).A digestão com tripsina em gel e a análise de manchas de gel selecionadas identificaram 144 peptídeos e resíduos fosforilados, dos quais apenas 18 fosfopeptídeos e 8 fosfositos foram encontrados nos bancos de dados de sítios de fosforilação PhosPhAt 4.0 e P3DB Arabidopsis thaliana.Mais da metade das 82 fosfoproteínas identificadas estavam envolvidas no metabolismo de carboidratos, fotossíntese/respiração ou mecanismos de resposta ao estresse oxidativo.O enriquecimento de fosfoproteínas intactas antes de 2-DE e LC-MS/MS parece aumentar a detecção de resíduos fosforilados de treonina e tirosina em comparação com métodos que utilizam enriquecimento em nível de peptídeo, sugerindo que as duas abordagens são um tanto complementares em termos de cobertura do local de fosforilação.A comparação dos resultados de plântulas jovens com os obtidos anteriormente para folhas maduras de Arabidopsis identificou cinco proteínas que são diferencialmente fosforiladas nesses tecidos, demonstrando o potencial dessa técnica para investigar a dinâmica da fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento da planta.