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Para quantificar especificamente vários metabólitos de 5-fluorouracil (5-FU) e dois nucleotídeos monofosfato endógenos, desenvolvemos um método original baseado em cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).Este ensaio permitiu a determinação de: (i) a produção intracelular de 5-fluoro-2'-desoxiuridina-5'-monofosfato (5-FdUMP) a partir de 5-FU ou 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUrd) , (ii) o impacto da concentração de 5-FdUMP na proporção intracelular de 2'-desoxiuridina-5'-monofosfato (dUMP)/timidina-5'-monofosfato (TMP), e (iii) a extensão da secreção de 5-FdUMP e 5-FU de células humanas cultivadas por transportadores ABC.Nas nossas condições experimentais, as células foram incubadas com 5-FU ou 5-FUrd.Em seguida, as proteínas celulares foram precipitadas por metanol.Este procedimento proporcionou alta recuperação de extração.Além disso, para medir a secreção de 5-FU e 5-FdUMP pelas células, realizamos a quantificação dessas moléculas em meio de cultura.Os meios foram injetados diretamente (5-FU) ou passaram por uma extração em fase sólida usando o cartucho de extração Oasis Wax (5-FdUMP).A separação dos analitos foi realizada em uma coluna dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm di) com modo isocrático usando tampão formato de amônio/metanol/água (5/5/90, v/v) como fase móvel.O tempo de execução não excedeu 6,2 min.Os analitos foram ionizados em uma interface de eletrospray no modo de íon negativo.Validamos o método em uma faixa de 2,5–150 ng mL −1 de acordo com os compostos.A variabilidade intra e interensaio foi inferior a 10% ao longo de sete dias.Todos os compostos foram estáveis ​​nas células ou no meio de cultura quando as amostras foram armazenadas a -20 °C por pelo menos duas semanas e após três ciclos de congelamento e descongelamento.Nenhum efeito de matriz foi observado em ambos os meios.