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A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO1) e a triptofano 2,3-dioxigenase (TDO) são duas enzimas estruturalmente diferentes que têm distribuição nos tecidos e funções fisiológicas diferentes, mas ambas catalisam a conversão do triptofano em N-formilquinurenina (NFK).O IDO1 foi clinicamente validado como um alvo de drogas de moléculas pequenas para o câncer, enquanto estudos pré-clínicos indicam que o TDO pode ser um alvo para a imunoterapia contra o câncer e doenças neurodegenerativas.Desenvolvemos um ensaio de triagem de alto rendimento para IDO1 e TDO com base em uma nova sonda química, NFK Green, que reage especificamente com NFK para formar uma molécula fluorescente verde com um comprimento de onda de excitação de 400 nm e um comprimento de onda de emissão de 510 nm.Fornecemos a primeira comparação lado a lado de vários inibidores publicados de IDO1 e TDO e revelamos que o inibidor pré-clínico de IDO1 Composto 5l mostra reatividade cruzada significativa com TDO, enquanto a seletividade relativa de outros inibidores publicados foi confirmada.A adequação para a triagem de alto rendimento dos ensaios foi demonstrada pela triagem de uma biblioteca de 87.000 substâncias químicas no formato de 384 ou 1.536 poços.Finalmente, demonstramos que o ensaio também pode ser usado para medir a capacidade das células de metabolizar o triptofano e medir a potência celular dos inibidores de IDO1 e TDO.