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Compreender o metabolismo do hospedeiro microbiano é essencial para o desenvolvimento e otimização de processos biocatalíticos baseados em células inteiras, pois determina a eficiência da produção.Isso é especialmente verdadeiro para a biocatálise redox, onde células metabolicamente ativas são empregadas devido à capacidade regenerativa do cofator/cosubstrato endógena no hospedeiro.Escherichia coli recombinante foi usada para superprodução de prolina-4-hidroxilase (P4H), uma dioxigenase que catalisa a hidroxilação de L-prolina livre em trans-4-hidroxi-L-prolina com a-cetoglutarato (a-KG) como cosubstrato.Neste biocatalisador de células inteiras, o metabolismo central do carbono fornece o necessário co-substrato a-KG, acoplando o desempenho biocatalítico do P4H diretamente ao metabolismo do carbono e à atividade metabólica.Aplicando ferramentas de biologia experimental e computacional, como engenharia metabólica e (13) C-análise de fluxo metabólico ((13) C-MFA), investigamos e descrevemos quantitativamente a resposta fisiológica, metabólica e bioenergética do biocatalisador de células inteiras à bioconversão direcionada e identificou possíveis gargalos metabólicos para uma engenharia de via ainda mais racional. Uma cepa de E. coli deficiente em degradação de prolina foi construída deletando o gene putA que codifica a prolina desidrogenase.As biotransformações de células inteiras com esta cepa mutante levaram não apenas à hidroxilação quantitativa da prolina, mas também à duplicação da taxa de formação específica de trans-4-L-hidroxiprolina (hyp), em comparação com o tipo selvagem.A análise do fluxo de carbono através do metabolismo central da cepa mutante revelou que o aumento da demanda de a-KG pela atividade de P4H não aumentou o fluxo gerador de a-KG, indicando uma operação do ciclo TCA fortemente regulada nas condições estudadas.Na linhagem tipo selvagem, a síntese e catálise de P4H causaram uma redução no rendimento de biomassa.Curiosamente, a cepa ΔputA compensou adicionalmente a perda associada de ATP e NADH reduzindo as demandas de energia de manutenção em taxas de absorção de glicose comparativamente baixas, em vez de aumentar a atividade do TCA. ser promissor para catálise produtiva de P4H não apenas em termos de rendimento de biotransformação, mas também em relação às taxas de biotransformação e absorção de prolina e rendimento de hip na fonte de energia.Os resultados indicam que, após um nocaute de putA, o acoplamento do ciclo TCA à hidroxilação de prolina através do cosubstrato a-KG torna-se um fator chave de restrição e um alvo para melhorar ainda mais a eficiência das biotransformações dependentes de a-KG.