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A maneira pela qual os efeitos de mutações simultâneas se combinam para alterar a atividade enzimática não é facilmente previsível porque esses efeitos nem sempre são aditivos de maneira linear.Assim, a caracterização dos efeitos de mutações simultâneas de resíduos de aminoácidos que se ligam ao substrato pode trazer uma contribuição significativa para a compreensão da especificidade do substrato das enzimas.Na beta-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), ambos os resíduos Q39 e E451 interagem com o substrato e isso é essencial para definir a especificidade do substrato.Mutantes duplos de Sfbetagly (A451E39, S451E39 e S451N39) foram preparados por mutagênese sítio-dirigida, expressos em bactérias e purificados por cromatografia de afinidade.Estas enzimas foram caracterizadas usando p-nitrofenil beta-galactosídeo e p-nitrofenil beta-fucósido como substratos.A razão k cat/Km para mutantes simples e duplos de Sfbetagly contendo mutações direcionadas ao sítio nas posições Q39 e E451 foi usada para demonstrar que o efeito na energia livre de ESdouble punhal (complexo de estado de transição enzimática) das mutações duplas (Gdouble daggerxy) não é a soma dos efeitos resultantes das mutações individuais (Gdouble daggerx e Gdouble daggery).Essa diferença na adaga Gdouble indica que os efeitos das mutações únicas se sobrepõem parcialmente.Portanto, esse efeito comum conta apenas uma vez em Gdouble daggerxy.Os dados cristalográficos das beta-glicosidases revelam a presença de uma ligação de hidrogênio bidentado envolvendo os resíduos Q39 e E451 e o mesmo grupo hidroxila do substrato.Portanto, os dados termodinâmicos e cristalográficos sugerem que os resíduos Q39 e E451 exercem uma influência mútua em suas respectivas interações com o substrato.